OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA TAU HUMANA RECOMBINANTE EN ESCHERICHIACOLI

Sergio Benjamín Socias (dir.); Solana Florencia López, Sergio Benjamín Socias; Rosana Nieves Chehín. IMMCA Instituto de Investigación en Medicina Molecular y Celular Aplicada CONICET-UNT-SIPROSA

Objetivo:
El Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada a nivel histopatológico, entre otras cosas, por marañas neurofibrilares intracelulares formadas por proteína Tau anormalmente fosforilada. Nuestro grupo de trabajo se encuentra abocado al estudio de la acción de ciertos inhibidores sobre la agregación patológica de Tau, pero la disponibilidad de la proteína humana pura limita marcadamente el avance de nuestras investigaciones.
El objetivo de este trabajo fue incrementar el rendimiento de la producción de la proteína humana Tau en la bacteria E. coli.
Metodología de trabajo:
Se analizó la producción de la proteína Tau en E. coli Rosetta, mediante transformación de dicha cepa con el plásmido portador del gen humano codificante para Tau, y posterior expresión de la proteína.
Se realizaron ensayos para determinar la formación de cuerpos de inclusión en los que podría estar precipitando nuestra proteína. Dichos cuerpos de inclusión se trataron con urea 8 M para favorecer su disolución, y se analizaron los resultados mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Se compararon estos resultados con el proceso realizado a 30°C, para determinar si la temperatura (T) influía en la formación de dichos cuerpos de inclusión.
Se analizó también, el efecto de la adición de etanol al medio de cultivo donde se llevó a cabo una producción rutinaria de la proteína.
El efecto de cada una de las condiciones ensayadas sobre el rendimiento de Tau se determinó por densitometría partir de geles de SDS-PAGE.
Resultados sobresalientes:
No se observó presencia de la proteína de interés en la cepa construida en laboratorio, en contraste con el control (cepa usada habitualmente) donde si hubo expresión de Tau.
La presencia de Tau en los pellets sin tratar y en los tratados con urea para disolver los cuerpos de inclusión, confirmó que el bajo rendimiento de producción se debe en parte al paso de la proteína a la fracción insoluble, tanto a 37°C como a 30°C. Por otro lado, no hubo disminución significativa en la formación de cuerpos de inclusión a menor temperatura.
Se determinó que la presencia de etanol en el medio de cultivo durante la expresión proteica, aumenta aproximadamente 3 veces la cantidad de proteína recuperada en su forma soluble.
Conclusión:
Se lograron establecer las condiciones que proporcionan un mayor rendimiento en la producción de Tau: 37°C-4hs-3%etOH. En dichas condiciones se observa una mayor proporción de proteína soluble.
El rendimiento final alcanzado al utilizar en simultáneo todas las variables significativas estudiadas a lo largo del trabajo fue 3 veces el de una producción rutinaria.